ПЛР Найпростіші. Розширена діагностика (6 видів, якісне визначення, кал)

Діагностичний напрямок

Інфекційне ураження організму

Загальна характеристика

Паразитарні інфекції є однією з провідних причин захворюваності та смертності від інфекційної діареї як у країнах, що розвиваються, так і в промислово розвинених регіонах.  
Проблема гіподіагностики: 
• Класичний мікроскопічний аналіз калу має низьку чутливість і високу залежність від людського фактора, через що багато паразитозів залишаються недіагностованими;
• Різноманітність збудників: Одночасна циркуляція багатьох видів найпростіших потребує комплексного підходу, оскільки клінічні прояви різних паразитозів часто ідентичні (діарея, біль у животі, мальабсорбція);
• Групи ризику: Особливу актуальність дослідження має для дітей (де інфекції викликають затримку росту та втрату ваги) та осіб із ослабленим імунітетом (у яких деякі найпростіші викликають тяжкі виснажливі патології). 

Метод мультиплексної ПЛР у реальному часі для виявлення паразитів шлунково-кишкового тракту є стандартом сучасної інфекційно-діагностичної практики.
Високу клінічну цінність цей метод має для тих категорій пацієнтів, де стандартна мікроскопія найчастіше є малоефективною, а наслідки недіагностованої інфекції — критичними:
1. Пацієнти з імуносупресією та онкопатологією
Для осіб із послабленим імунітетом кокцидії (такі як Cryptosporidium spp. та Cyclospora cayetanensis ) є опортуністичними патогенами.
У звичайних пацієнтів ці інфекції викликають помірну діарею, а у хворих на ВІЛ/СНІД, пацієнтів після трансплантації (на імуносупресивній терапії) чи під час хіміотерапії вони зумовлюють важку, виснажливу, профузну діарею , що загрожує. ПЛР дозволяє виявити їх на порядок швидше і точніше, ніж специфічне забарвлення за Цілем-Нільсеном.
2. Діти раннього та дошкільного віку
Діти є головною групою ризику для таких інфекцій, як лямбліоз ( Giardia lamblia ). Через непостійний та хвилеподібний характер виділення цист (період "німого вікна" може тривати тижнями), звичайна мікроскопія калу часто дає хибнонегативні результати.
Хронічний протозооз у дитини веде до синдрому мальабсорбції, гіповітамінозу, затримки фізичного розвитку та хронічної інтоксикації. ПЛР виявляє навіть поодинокі фрагменти ДНК руйнування вегетативних форм.
3. Пацієнти з хронічними гастроентерологічними розладами (потенційний СПК)
Часто пацієнти роками лікуються від "синдрому подразненого кишечника" (СПК), функціональної диспепсії або неспецифічного коліту.
Такі патогени, як Blastocystis hominis та Dientamoeba fragilis , дуже часто пропускаються при рутинному аналізі калу на яйця паразитів. Виявлення їх ДНК дозволяє встановити реальну етіологію хронічного болю в животі, метеоризму та нестійкого випорожнення та повністю вилікувати пацієнта коротким курсом антипротозойної терапії.
4. Мандрівники та туристи («Діарея мандрівників»)
Особи, які повернулися з країн із низьким рівнем санітарії, ендемічних регіонів (Азія, Африка, Південна Америка) або вживали воду з неперевірених джерел.
Затяжна діарея (що триває понад 10–14 днів) у мандрівників найчастіше має саме протозойну етіологію ( Giardia, Entamoeba histolytica, Cyclospora ). Оскільки лікування бактеріальної та паразитарної інфекцій принципово різне, ПЛР допомагає уникнути помилкового призначення стандартних антибіотиків, які лише погіршать стан мікробіоти.
5. Пацієнти з підозрою на амебіаз ( Entamoeba histolytica )
Під мікроскопом неможливо відрізнити патогенну Entamoeba histolytica (яка викликає важку амебну дизентерію та абсцеси печінки ). ПЛР — єдиний доступний метод, який диференціює їх на генетичному рівні, рятуючи пацієнта від непотрібного агресивного лікування або, навпаки, запобігаючи небезпечним ускладненням інвазивного амебіазу.

Основні переваги методу:
• Цільова мультиплексність: одночасне виявлення 6 клінічно значущих найпростіших патогенів ШКТ за один аналітичний цикл.
• Висока аналітична чутливість: гарантоване виявлення збудників навіть за мінімального рівня паразитарного навантаження у зразку.
• Виняткова специфічність: точна ідентифікація найпростіших завдяки таргетному визначенню унікальних ділянок ДНК, що виключає перехресні реакції.
• Подолання обмежень мікроскопії: ефективна діагностика форм найпростіших, які дуже важко чи неможливо візуалізувати за допомогою стандартних мікроскопічних методів (наприклад, диференціація E. histolytica від непатогенних амеб).
• Об'єктивізація результатів: повна незалежність аналізу від суб'єктивного людського фактора та кваліфікації лікаря-лаборанта.
• Оптимізація часу: суттєве прискорення верифікації етіологічного діагнозу для своєчасного початку цільової терапії

Показання для призначення

Дослідження показане в таких клінічних ситуаціях:
1.Гостра або затяжна діарея нез'ясованої етіології , коли стандартні бактеріологічні посіви калу та експрес-тести на вірусні антигени (рота-, адено-, норовіруси) дали негативний результат.
2.Хронічні шлунково-кишкові розлади тривалістю понад 7–14 днів: регулярний біль чи дискомфорт у животі, стійкий метеоризм, нудота, нестійкі випорожнення (чергування запорів та діареї).
3.Тривалий субфебрилітет (підвищення температури тіла до 37,2–37,5°C) , що супроводжується диспепсичними явищами та непов'язаний із респіраторними інфекціями.
4.Клінічні ознаки синдрому мальабсорбції та синдрому виснаження : незрозуміла втрата ваги, стеаторея, ознаки гіповітамінозу, залізодефіцитна анемія нез'ясованого генезу (особливо у дітей).
5.Діарея мандрівників: поява розладів ШКТ під час або після повернення з країн із тропічним/субтропічним кліматом чи регіонів із низьким рівнем санітарної культури.
6.Скринінг пацієнтів перед початком або під час імуносупресивної терапії , перед трансплантацією органів, курсами хіміотерапії, а також у пацієнтів із ВІЛ-інфекцією/СНІДом при виникненні найменших шлунково-кишкових розладів.
7.Підозра на інвазивний амебіаз чи необхідність диференційної діагностики між патогенною Entamoeba histolytica та непатогенними амебами за наявності ультразвукових чи КТ-ознак абсцесів печінки.
8.Диференційна діагностика із функціональними розладами кишечника , в тому числі через підозру на постінфекційний синдром подразненого кишечника (СПК) для виключення персистуючої протозойної інвазії ( Blastocystis hominis , Dientamoeba fragilis ).
9.Неефективність емпіричної терапії антибіотиками широкого спектра дії при кишкових розладах.
10.Епідеміологічне обстеження контактних осіб у вогнищі протозойних інфекцій (у сім'ях, дитячих дошкільних закладах, школах, інтернатах чи військових частинах) при виявленні спалаху гастроентериту.

Маркер

Маркер кишкових протозойних інфекцій, що базується на якісному виявленні ДНК клінічно значущих найпростіших у калі методом мультиплексної ПЛР у режимі реального часу.

Клінічна значущість

Правила підготовки

Правила доставки біоматеріалів до лабораторії

Інтерференція:

• На результат можуть впливати:
  - надлишок складних полісахаридів рослинного походження
  - надлишок жовчних солей та кислот
  - надлишок гемоглобіну та його похідних
  - надлишок гумінових та фенольних сполук
  - лікарські препарати  (антибіотики , антациди та сорбенти, проносні засоби, нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП)).
  1.Проносні засоби на олійній основі (вазелінова, рицинова олія) або препарати з високим вмістом магнію чи вісмуту (наприклад, де-нол);
  2.Ректальні креми, мазі, свічки використані напередодні збору біоматеріалу;
  3.Сорбенти та барієва суміш (якщо пацієнт проходив рентгеноконтрастні дослідження ШКТ менше ніж за 48-72 години до здачі дослідження).
  4.ПЛР виявляє нуклеїнові кислоти як живих, так і вже зруйнованих або нежиттєздатних паразитів (наприклад, на тлі або відразу після завершення курсу санації антипротозойними препаратами);
  5.Метод не рекомендовано використовувати для контролю вилікованості у перші дні після закінчення терапії (можливі хибнопозитивні результати через залишкову ДНК)

Інтерпретація:

• Інтерпретацією результату повинен займатися кваліфікований фахівець, який чітко розуміє переваги та обмеження тесту, у контексті всіх клініко-анамнестичних даних. Неправильне використання тесту може збільшити ймовірність постановки помилкового діагнозу та призвести до непотрібних втручань і зниження якості життя пацієнта.
  Позитивний результат (+) виявлено:
  • Клінічне значення: Підтверджує наявність генетичного матеріалу (ДНК) відповідного найпростішого у зразку калу.
  • Нюанс для умовно-патогенної флори ( Blastocystis hominis , Dientamoeba fragilis): Виявлення ДНК свідчить про колонізацію або інвазію. Клінічну значущість (чи є патоген причиною симптомів пацієнта) лікар-клініцист оцінює комплексно, зважаючи на наявність скарг.

• Негативний результат (-) не виявлено:
  • Клінічне значення: ДНК згаданих найпростіших у досліджуваному зразку не виявлено (або її концентрація є нижчою за межу аналітичної чутливості методу).